Thực hành tách chiết và nhận biết ADN ở tế bào thực vật

Công ty Đức Mai Khôi sẽ giới thiệu đến bạn cách thực hành tách chiết và nhận biết ADN ở tế bào thực vật dưới đây. Chi tiết liên hệ số hotline để được tư vấn thông tin hữu ích 24/24.

Mục tiêu thực hành tách chiết và nhận biết ADN ở tế bào thực vật

Thực hiện được việc tách chiết ADN khỏi tế bào thực vật, nhận diện ADN thu được bằng phản ứng màu với diphenynlamine.
Phân tích được bản chất và ý nghĩa của các bước thực hiện trong quy trình tách chiết ADN ở tế bào thực vật.
Rèn kĩ năng tiến hành thí nghiệm trong dạy học môn Khoa học tự nhiên.

Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, mẫu vật

1. Dụng cụ

Dụng cụ cho mỗi nhóm gồm: Bể ổn nhiệt (1 cái); cân điện tử (1 cái); máy xay sinh tố nếu có (1 cái); túi zip hoặc túi nilon (3 cái); lưới lọc hoặc vải lọc (3 tấm kích thước khoảng 20*20cm); phễu lọc (1 cái); cốc thủy tinh 100ml (4 cái); đũa thủy tinh (2 cái); ống hút nhỏ giọt (5 cái); ống nghiệm (5 cái) và giá ống nghiệm (1 cái); dao cắt hoặc kéo (1 cái); khăn lau (1 cái); muỗng múc hóa chất (1 cái); cối chày sứ (1 bộ).

Tham khảo: Hướng dẫn sử dụng tiêu bản tes bào thực vật

2. Hóa chất, mẫu vật

– Mẫu vật mỗi nhóm chuẩn bị gồm: Chuối sứ chín (2 quả); hành tây (1 củ); 1 quả thơm (dứa) nên chọn loại vừa bắt đầu chín.

– Hóa chất phòng thí nghiệm chuẩn bị cho 1 lớp (6 nhóm) gồm: nước cất (500ml); cồn ethanol 70^olạnh (2 lít); nước rửa chén (chai 500ml); dung dịch muối NaCl 0,9% (1 lít); dung dịch diphenylamine pha sẵn (100ml). Thuốc thử diphenylamine được pha như sau: hòa tan 1g diphenylamine (C₆H₅)₂NH trong 100ml acid acetic đặc, thêm 2,75ml acid sulfuric H₂SO₄ đặc và khuấy đều; đựng trong lọ thủy tinh tối màu có nút kín, cất trong ngăn mát tủ lạnh. Nên làm ấm dung dịch ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

3. Tiến hành

– Chuẩn bị dịch chiết dứa có chứa enzyme phân giải protein

Các nhóm thực hiện như sau: Gọt vỏ dứa và cắt thành lát mỏng, nhỏ; nghiền với cối chày sứ hoặc máy xay sinh tố; lọc qua vải màn sẽ thu được dịch chiết dứa. Có thể cất trong ngăn mát tủ lạnh để dùng cho thí nghiệm.

– Quy trình tách chiết ADN

Bước 1: Nghiền mẫu:

– Đối với chuối chín: lột vỏ, cân khoảng 50g chuối, cắt nhỏ cho vào túi zip hoặc túi nilon, bổ sung thêm 20ml dung dịch muối NaCl 0,9%, dùng tay nghiền nát.

– Đối với hành tây: cân 50g hành tây, cắt nhỏ và nghiền bằng cối chày sứ, bổ sung thêm 20ml dung dịch muối NaCl 0,9%, khuấy đều. Ion Na⁺ trong NaCl với nồng độ cao sẽ giúp tách sơ bộ ADN ra khỏi protein. Lọc lấy 30ml dịch chiết từ chuối, hoặc hành tây, vừa nghiền ở bước trên bằng vải lọc.

Bước 2: Cho 10ml dung dịch nước rửa chén vào cốc chứa sẵn 30ml dịch chiết chuối hoặc hành tây, khuấy nhẹ trong khoảng 2-5 phút. Nước rửa chén có chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) là chất tẩy hoạt động bề mặt lưỡng tính, vì mang điện tích nên chất tẩy ion hóa có thể phá vỡ liên kết ion và liên kết hidro, có tác dụng biến tính hoàn toàn protein do chất này liên kết với tất cả các nhóm R của protein, phá hủy màng lipit kép của tế bào và nhân bằng cách xen vào giữa hai lớp phospholipit kép. Tạo điều kiện cho việc kết tủa và cô lập ADN ở các bước kế tiếp.

Bước 3: Bổ sung 5-10ml dịch chiết dứa, để yên 2-3 phút. Nước cốt dứa được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi phân tử ADN. Chúng chứa enzyme bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid trong phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ là các peptide. Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải các protein histon gắn trên phân tử ADN. Tạo thuận lợi cho việc thu hồi ADN tinh sạch;

Bước 4: Rót từ từ ethanol 70% lên thành cốc sao cho lượng ethanol gấp đôi lượng dịch nghiền trong cốc, sau 1 phút sẽ thấy xuất hiện các phân tử màu trắng đục kết tủa và tụ lại do ADN tan trong nước nhưng không tan trong cồn, dưới tác động của lực vật lí sẽ nổi lên trên bề mặt.

Bước 5: Chuẩn bị sẵn 1 ống nghiệm chứa 10ml diphenylamine. Dùng đũa thủy tinh hoặc muỗng múc hóa chất thủy tinh nhẹ nhàng vớt phần kết tủa màu trắng cho vào ống nghiệm chứa dung dịch diphenylamine, đun cách thủy ống nghiệm trên trong 10 phút sẽ thấy xuất hiện màu xanh lam chứng tỏ mẫu kết tủa thu được là ADN. ADN phản ứng với diphenylamine dựa vào sự chuyển đổi của đường deoxyribose có trong phân tử ADN (không có trong ARN), khi bị thủy phân ở nhiệt độ cao trong môi trường acid tạo thành hydroxylevulinyl aldehyde phản ứng với diphenylamine tạo phức hợp màu xanh lam bền vững. Cường độ màu xanh lam tỉ lệ thuận với nồng độ của ADN [6], [1], [5], [4], [7].

Hình 1: Hóa chất chuẩn bị thực hành tách chiết và nhận biết ADN ở tế bào thực vật

Hình 2: Quy trình thực hiện

Hình 3: Nhận biết ADN ở tế bào thực vật

Một số câu hỏi thường gặp

1. Trong quy trình thực hành tách chiết và nhận biết ADN ở tế bào thực vật, nếu không sử dụng nước chiết dứa có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm hay không? Vì sao? Hãy thiết kế thí nghiệm để chứng minh nhận định của anh/chị.

2. NaCl có vai trò gì trong quy trình tách chiết ADN? Nồng độ NaCl có ảnh hưởng đến tỉ lệ ADN thu được hay không? Hãy thiết kế thí nghiệm để chwusng minh nhận định của anh/chị.

Tài liệu tham khảo

J. B. R. Neil A. Campbell và các cộng sự. (2016), Biology, Pearson Benjamine Cummings,.
Đặng Thị Ngọc Thanh , Lê Minh Đức (2013), Cải tiến quy trình làm tiêu bản di truyền học ở bậc trung học phổ thông, chủ biên, Đề tài NCKH cấp trường, ĐH Sài Gòn.
Phan Thị Hoan (2006), Thực tập Di truyền Y học, NXB Y học, Hà Nội.
Nguyễn Thị Hồng Nhung (2019), Giáo trình Thực tập Sinh học và Di truyền, NXB Y học.
Mai Sĩ Tuấn (2013), Thực hành sinh học trong trường phổ thông, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội.
Nguyễn Xuân Viết (2016), Giáo trình Thực hành sinh học tế bào, NXB Đại học Sư phạm, Hà Nội.
Lê Minh Đức, Phan Đức Duy và Lữ Thị Thanh Nga (2020), “Xử lí tình huống khi tách chiết ADN trong chương trình cấp Trung học Phổ thông“, tạp chí Khoa học đại học Huế: Khoa học Xã hội và Nhân văn. tập 129, số 6A, tr67-75.